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實時熒光定量PCR服務在實際應用中的定量分析法

發(fā)布日期： 2020-01-10
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 　　實時熒光定量PCR是一種在擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環(huán)后產物的總量，通過內參或者外參法對待測樣品中的特定基因序列進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR服務包括SYBRGreen熒光定量和TaqMan探針PCR，提供檢驗設計,RNA提取、標準品制備,數據分析和詳盡的實驗報告。所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。  
　　1. Ct值的定義 
　　在熒光定量PCR技術中，有一個很重要的概念 -- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數。  
　　2. 熒光域值（threshold）的設定 
　　PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-15  
　　3. Ct值與起始模板的關系 
　　研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
　　實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。